很大一部分遗传病是由单核苷酸甲基化招致的，这种甲基化有可能被RNA可编程脱甲醇蛋白（被称为残基编者器（BEs））当作为靶标。BEs通过尿嘧啶和肌苷中亦会间产物，通过螺旋形DNA特异性双碱基或天冬氨酸脱甲醇蛋白，使单个C·G到T·A或A·T到G·C脱氧核糖核酸生成，这些蛋白与甲醇毁损的Cas9融入。 这些脱氧核糖核酸切换脱离于核酸DNA松脱或关联性定向翻修，并且并不需要在细胞周期后第三有组织中亦会在体液顺利进行有效编者。近来的体外研究课题说明，胞苷残基编者（CBEs）可以在细胞内中亦会招致成千上万个sgRNA脱离核苷酸第三组的广泛脱靶甲基化，在抑止多能干细胞内和细胞内期卵子中亦会招致数百个全蛋白质的脱靶甲基化。总之，这些数据说明，CBE的表述可能亦会对病患者的应用领域助长相当大的后果，本文审核体液体第三有组织中亦会双碱基残基编者更大幅度中亦会的脱靶物理现象，并建立一种使CBE表述一段时间内最小化的传递新方法。
为了审核CBEs在体液的非抑制剂脱甲醇功用，本文重点研究课题了Pahenu2果蝇尿症仿真，该仿真可以通过AAV抑止的粉红色葡萄球菌（Sa）KKH–CBE3系统转入果蝇肾细胞内来治愈。常用双AAV-intein分裂系统将其系统带入Pahenu2果蝇中亦会，以更正胺基酸中亦会招致疾病的T-to-C甲基化。首先常用RNA化学合成审核核苷酸第三组区域内的脱靶去甲醇功用。将表述SaKKH–CBE3的真核生物转染到HEK293T细胞内中亦会致使平均39000个C-to-U切换。为了确定在肾内双碱基残基编者更大幅度中亦会有否时有发生完全相同的核苷酸第三组区域内的脱靶甲基化率，常用AAV8将SaKKH–CBE3系统地带入Pahenu2果蝇。8周后，当AAV载体的转蛋白质表述达到平均值时，从肾细胞内提取RNA，并常用RNA蛋白质统计分析。尽管通过观察到23%的靶标编者，与处理方式过程的IgG远比，核苷酸第三组区域内的C-to-U切换不亦会减少。
双碱基编者优先时有发生在处理过程过的HEK293T细胞内中亦会ACW的的现代APOBEC一致蛋白质内，但在处理过程过的果蝇肾细胞内中亦会不时有发生。有趣的是，当来得不同样本中亦会的SaKKH-CBE3表述时，通过观察到HEK293T细胞内的核苷酸素质比肾细胞内高三个总能量。为了研究课题CBE主因表述有否与体外高非靶标编者时有发生率相关，将阿司匹林的SaKKH-CBE3 mRNA和sgRNA转染到含有Pahenu2蛋白质座胺基酸7的HEK293T和Hepa细胞内中亦会。与真核生物转染远比，CBE表述减低了18倍，在靶标编者时保留了63%，但显著减低了RNA脱靶甲基化。
年中审核了AAV抑止的将SaKKH–CBE3为基础Pahenu2果蝇有否亦会致使蛋白质DNA的脱靶编者。在原本的研究课题中亦会不亦会断定在数据分析的非靶蛋白质座上有sgRNA持续性甲基化，但在第三有组织的残基编者更大幅度中亦会有否时有发生随机的非sgRNA持续性非靶蛋白质甲基化仍不清楚。每个细胞内的这些甲基化是不同的，不会用细胞内中亦会大量DNA的全蛋白质化学合成来检查。从经疗法和擅自疗法的对照果蝇中亦会分离肾细胞内，并在化学合成前将其奎尔为基础为化学抑止的肾祖细胞内（CLiP）。并不需要取得S的奎尔DNA，从擅自处理过程的对照哺乳类中亦会选取了3个奎尔，从AAV处理过程的哺乳类中亦会选取了11个奎尔，并在30×增幅的S目标残基顺利进行了确认编者。AAV抑止的SaKKH–CBE3表述转入肾细胞内后，不亦会致使肾细胞内对RNA和蛋白质DNA的大量脱靶脱甲醇功用。
对编者果蝇的Pahenu2蛋白质的大幅度统计分析结果显示，由于对侧DNA碱基同时顺利进行上端和残基动手术翻修，SaKKH–CBE3表述致使靶蛋白质频繁过渡到indel。为了减低indel的过渡到，用方式中死亡的SaKKH–CBE2和Gam–SaKKH–CBE4互换了SaKKH–CBE3，这是第四代BE，其中亦会噬菌体Mu引申的Gam抗原与核酸DNA松脱的相辅相成被视为可以减低indel的过渡到、。然而，尽管SaKKH–CBE2和Gam–SaKKH–CBE4致使多于的indels。
年中统计分析了LNP抑止的肾细胞内残基编者有否亦会致使RNA或DNA的脱靶脱甲醇。受限于这种新方法只致使SaKKH–CBE3的瞬时表述，注射3毫克/千克的剂量后48全程顺利进行了RNA蛋白质统计分析。极为重要的是，断定CBE表述素质在人体内mAPOBEC1的区域内内，与擅自疗法的IgG远比，不亦会致使C-U切换减少。此外，双碱基编者这不优先时有发生在的现代的APOBEC共识蛋白质中亦会。LNP给药一个月后，SaKKH–CBE3表述完全消失，绝不无论如何，终于不亦会通过观察到C-to-U脱靶甲基化。为了大幅度审核LNP抑止的SaKKH–CBE3传递有否致使蛋白质DNA的脱靶去甲醇功用，首先常用高通量化学合成（HTS）（>10000×增幅）统计分析了计算数据分析的脱靶loci。通过观察到这些残基不亦会高于背景素质的C-to-T生成。年中重点研究课题sgRNA非持续性脱靶甲基化，并在疗法一个月后分离肾细胞内顺利进行奎尔为基础。依靠LNP抑止的SaKKH-CBE3 mRNA和化学修饰的sgRNA的残基编者并不需要校正疾病表型，而不亦会在核苷酸第三组和蛋白质上检查到脱靶去甲醇功用。
本文整合了一种非感染和短暂的残基编者新方法来疗法单蛋白质肾病，不亦会值得注意的脱靶物理现象。较强极高的外科前景。
Villiger, L., Rothgangl, T., Witzigmann, D. et al. In vivo cytidine base editing of hepatocytes without detectable off-target mutations in RNA and DNA. Nat Biomed Eng 5, 179–189 (2021).
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